سنجش پروتئین (BCA)

سنجش بی سی آ (BCA) یک سنجش رنگ سنجی دو مرحله ای است که برای تعیین کمیت کل پروتئین در یک نمونه استفاده می شود. این روش از واکنش بیورت استفاده می کند که در آن مس دو ظرفیتی توسط پروتئین در یک محیط قلیایی به مس تک ظرفیتی کاهش می یابد. ستون فقرات آمینو اسید یک کمپلکس رنگ-کلات با مولکول های مس تشکیل می دهد که امکان تشخیص بسیار حساس و انتخابی کاتیون مس را فراهم می کند. در واقع مقدار مس دو ظرفیتی کاهش یافته تابعی از غلظت پروتئین است که با تغییر رنگ محلول نمونه از آبی به بنفش، که در 562 نانومتر نوری جذب می کند، می تواند به صورت اسپکتروفتومتری با دستگاه هایی چون اسپکتروفتومتر، نانودراپ و میکروپلیت ریدر تعیین شود. مشخصا میزان غلظت پروتئین موجود در محلول با میزان جذب خوانش شده توسط دستگاه هایی چون اسپکتروفتومتر، نانودراپ، میکروپلیت ریدر متناسب است، با این شرایط این امکان فراهم است که آن را با مقایسه با یک استاندارد پروتئین شناخته شده مانند آلبومین سرم گاوی (BSA) تخمین زد.

در روش BCA شاهد تداخلاتی هستیم که بعضی از آنها سازنده و برخی دیگر در روند کار اختلال ایجاد میکنند.

از جمله تداخلات سازنده در این روش میتوان به  مواد شوینده یونی و غیر یونی و مواد دفع کننده اشاره کرد (NP-40، Emulgen، HEPES، DTT، Triton X-100، Urea، Guanidine HCl، Sodium Acetate, pH 5.5).

و تداخلاتی که باعث اخلال در روند ازمایش میشوند:

1. برخی از معرفها، مانند اسید اتیلن دی آمینتراستتیک(EDTA) ، با کاهش قندها و لیپیدها، می توانند در آزمایش  BCA اختلال ایجاد کنند.
2. وجود باقیمانده های شیمیایی اصلاح شده در پروتئین

برای کاهش اثر تداخلاتی که باعث ایجاد اختلال میشوند، راهکارهایی وجود دارد:

• کاهش مواد مداخله کننده از طریق دیالیز
• فیلتراسیون ژل
• اگر غلظت پروتئین به اندازه کافی بالا باشد، با رقیق کردن نمونه میتوان اثر اختلال را کاهش داد.

به طور کلی روش BCA جزو روش هایی محسوب میشود که مزایای زیادی دارد. به طور مثال میتواند پروتئین ها را در غلظت های کم 5 میکروگرم بر میلی لیتر تشخیص دهد؛ به عبارتی بسیار حساس است و میتواند طیف گسترده ای از غلظت پروتئین ها را در بر بگیرد.

روش لوری

روش لوری (Lowry) برای تعیین مقدار کمی پروتئین توتال در سرم خون به کار برده می شود. این روش نیز به مانند سایر تست های رنگ سنجی، به یک منحنی استاندارد نیاز دارد که باید قبل از اندازه گیری پروتئین های نمونه ترسیم شود.

در یک توضیح اجمالی، روش لوری دارای دو مرحله واکنش می باشد در مرحله اول، نیتروژن های پیوندهای پپتیدی در پروتئین با مس دو ظرفیتی CuSO₄ در محلول قلیایی واکنش می دهد و در نتیجه Cu²⁺ بهCu⁺¹ کاهیده می شود و کمپلکس پروتئین Cu²⁺ به رنگ بنفش- ارغوانی شکل می گیرد. در مرحله دوم با اضافه کردن معرف فولین و واکنش های صورت گرفته، در نهایت محلول به رنگ آبی در می آید که در محدوده طول موج 650 تا 750 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر، نانودراپ، میکروپلیت ریدر قابل خوانش می باشد.

معرف ها و استاندارد های مورد استفاده در این روش معمولا به صورت آماده و در کیت های تجاری شده سنجش غلظت پروتئین (روش لوری) موجود می باشند.

توجه: از آنجا که نانودراپNDNM96  می تواند غلظت های بالاتری از پروتئین را نسبت به اسپکتروفتومترهای مرسوم مبتنی بر کووت اندازه گیری کند، لذا ممکن است شما به استانداردهایی با غلظت های بالاتری از آنچه که در دستور العمل کیت تجاری ارائه شده، نیاز پیدا کنید.

این روش نسبت به سایر روش ها زمان بیشتری نیاز دارد؛ اما میتوان با افزایش درجه حرارت کمی از این زمان کاست. از جمله مزایای روش میتوان به دقت و حساسیت آن اشاره کرد. ترکیبات که معمولاً در بافرها برای تهیه پروتئین مورد استفاده قرار میگیرند (مانند مواد شوینده، کربوهیدرات ها، گلیسرول، تریسین، EDTA ، تریس) در سنجش لوری دخالت می کنند و رسوبات را تشکیل می دهند.

روش برادفورد

سنجش پروتئین برادفورد تکنیکی است که توسط برادفورد (1976) ابداع شد؛ و برای اندازه گیری غلظت کل پروتئین در یک نمونه استفاده می شود. درواقع براي اندازه‌گيري غلظت پروتئين‌های فراكشن‌هاي سلولي و ارزيابي غلظت پروتئين در ژل هاي الكتروفورز مي‌باشد. اصل این روش این است که اتصال مولکول های پروتئین به رنگ کوماسی در شرایط اسیدی منجر به تغییر رنگ از قهوه ای به آبی می شود. این روش در واقع حضور باقی مانده‌های اسید آمینه پایه، آرژنین، لیزین و هیستیدین را اندازه‌گیری می‌کند که به تشکیل کمپلکس پروتئین-رنگ کمک می‌کند. در اين ميان، اتصال كوماسي بلو به آرژينين حائز اهميت مي‌باشد؛ چراکه مقدار رنگ متصل شده، وابسته به محتواي اسيدهاي آمينه بازي پروتئين مي‌باشد. بر خلاف روش BCA، عوامل کاهنده (به عنوان مثال، DTT و بتا-مرکاپتواتانول) و شلاتورهای فلزی (به عنوان مثال، EDTA ،EGTA ) در غلظت کم باعث تداخل نمی شوند. با این حال، وجود SDS حتی در غلظت های پایین می تواند در اتصال پروتئین به رنگ تداخل ایجاد کند. این تکنیک نسبت به عوامل مختل کننده در روش لوری نیز حساسیت کمتری دارد.

مزایای روش

• نسبت به سایر روش ها سریع و آسان است.
• اندازه‌گيري در دماي اتاق انجام گرفته و وسيله خاصي مورد نياز نمي‌باشد.
• تهيه معرف‌هاي اين روش آسان بوده و رنگ ایجاد شده ضمن پایدار بودن، به سرعت روی میدهد.
• سازگار با اغلب نمك‌ها، حلال‌ها، بافرها، تيول‌ها، تركيبات احيا كننده و عوامل شلاته كننده در نمونه‌هاي پروتئيني
• امکان اتوماتیک سازی روش به دلیل کم بودن محلول ها و سادگی آن گسترش یافته است.

 روش پیرس (Pierce)

کمیت پروتئین کل یک اندازه گیری رایج در آزمایشگاه های علوم زیستی، بیودارویی و مواد غذایی و نوشیدنی است. برخی از رایج‌ترین روش‌های مورد استفاده برای تعیین کمیت پروتئین کل، سنجش‌های اتصال رنگ هستند، مانند سنجش برادفورد مبتنی بر کوماسی. اگرچه روش برادفورد بسیار مورد استفاده قرار می گیرد، معایب متعددی دارد. بسیاری از مواد، از جمله برخی مواد شوینده، فلاونوئیدها و بافرهای پروتئینی شناخته شده اند که با خواص رنگ سنجی متکی بر این روش تداخل دارند. علاوه بر این، خطی بودن سنجش برادفورد هم از نظر کیفیت و هم در محدوده محدود است. سازگاری گسترده با مواد و خطی بودن بهبود یافته سنجش 660 نانومتری Pierce در ترکیب با فرمت ساده و تک معرف آن، آن را به روشی دقیق‌تر و راحت‌تر برای بسیاری از کاربردهای معمول تبدیل می‌کند.

سنجش پروتئین 660 نانومتری Pierce یک روش رنگ سنجی سریع و آماده برای تعیین کمیت پروتئین کل است. این روش تکرارپذیر، سریع و خطی تر از روش برادفورد است. علاوه بر این، تست پروتئین 660 نانومتری Pierce با غلظت‌های بالای معرف‌های رایج مورد استفاده، مانند شوینده‌ها و مواد کاهنده، سازگار است. مانند روش برادفورد، غلظت پروتئین با ارجاع به یک سری رقت‌های پروتئین استاندارد که در کنار نمونه‌های ناشناخته مورد سنجش قرار گرفته‌اند، تخمین زده می‌شود. هر روش سنجش پروتئین کل درجاتی از پاسخ متفاوت نسبت به پروتئین های مختلف را نشان می دهد. این تفاوت‌ها به تغییرات در توالی اسید آمینه، نقطه ایزوالکتریک، ساختار و وجود زنجیره‌های جانبی خاص یا گروه‌های مصنوعی مربوط می‌شوند که می‌توانند به طور چشمگیری پاسخ رنگ پروتئین را تغییر دهند. بنابراین، انتخاب یک پروتئین مرجع مناسب کلید دستیابی به نتایج با کیفیت بالا است. پروتئین ایده آل برای استفاده به عنوان استاندارد مرجع در هر سنجش پروتئین، آماده سازی خالص شده از همان پروتئین است که باید در نمونه اندازه گیری شود. در غیاب چنین پروتئین مرجع، ممکن است از پروتئین جایگزینی استفاده شود که پاسخ رنگی مشابهی با پروتئین نمونه ایجاد کند.

دو جایگزین رایج برای پروتئین مرجع عبارتند از: آلبومین سرم گاوی (BSA) و گاما گلوبولین گاوی (BGG). زمانی که نمونه عمدتاً آلبومین داشته باشد، یا پروتئین نمونه واکنشی مشابه BSA به رنگ داشته باشد، BSA استاندارد مناسبی است. برای پاسخ رنگی که نمونه آنتی بادی های خالص شده و بیشتر مخلوط های پروتئینی غیر سرمی (مانند لیزات سلولی) است، BGG یک پروتئین استاندارد مناسب است.